BAC提取前准备（前两天 ）

    配制含25 mg/l Kan的LB培养基选择平板，在超净工作台上用接种环从购买的BAC划线接种至选择平板，于37℃培养箱培养过夜，供选择单。ELISA试剂盒

BAC提取前准备（前一天）

、在超净工作台上，用50 µg/ml Kan和液体LB培养基配制成25 mg/l Kan培养基，每个Falcon试管分装0 ml。也可先分装0 ml无抗生素的液体LB培养基后，然后每管中加5 µl浓度为50 µg/ml Kan溶液。

2、在培养皿中标出三个单克隆 （不要太大，不要太小），用牙签挑取第个单克隆 一半，在的的小培养皿固体LB培养基（分装0 ml，含25 mg/l Kan）上划一横线，标上序号；接着用同一根牙签挑取第个单克隆的另一半接种到刚配制好的液体培养基中。第2、3个单分别用牙签挑取在同一个小培养皿固体LB培养基上划一横线，分别标上序号。

3、接种的固体培养基置于37℃培养箱过夜。接种到Falcon试管中的E.coli 进行液体振荡培养（37℃，240 rpm）20小时。

BAC提取（第二天）

    将缓冲液P按要求加入RNase A，置于冰上。缓冲液P3也置于冰上。取出适量缓冲液QF在65℃条件下预热。其他缓冲液在常温下保存。

、接种的固体培养基从37℃培养箱中取出，用包装膜封好后置于4℃条件下贮存。取液体振荡培养的Falcon试管到超净工作台中，在微量离心管中分装300 µl的E.coli 和300 µl 30%glycerol的LB培养基，用移液器上下吹吸混匀，置于-80℃贮存。

2、将Falcon试管在室温条件下2700 rpm离心20 min。丢弃上清，将沉淀置于冰上。

3、在0.6 ml缓冲液P中重悬细菌沉沉小球。边吹吸边搅动，混匀而不要出块菌块，然后全部转移到2 ml 微量离心管中。ELISA试剂盒

4、加入0.6 ml缓冲液P2，上下倒置数次，轻轻混和，在室温下培养5 min。

5、加入0.6ml冰冷的缓冲液P3，立即上下倒置数次，轻轻混和，在冰上培养5 min。

6、用微量离心器在zui大速度下（3000 rpm）离心0 min。此时可支起过滤架，标好QIAGEN-tip 20尖管。

7、利用 ml缓冲液QBT对QIAGEN-tip 20尖管进行平衡处理，让其在重力作用下从柱中流出。

8、将离心后的上清倒入QIAGEN-tip 20尖管，让其在重力作用下进入树脂。

9、用4 ml缓冲液QC对QIAGEN-tip 20尖管进行清洗2次，每次用2 ml。

0、清洗后将.5 ml或2 ml微量离心管置于QIAGEN-tip 20尖管头下，用0.8 ml预热的缓冲液QF分两次稀释DNA 。每次0.4 ml。

、用0.7体积（每0.8 ml稀释体积用0.56 ml）的isopeopanol在室温下沉淀DNA 。立即用微量离心机中在3000 rpm 转速下离心30 min。此步以后在离心机上操作要注意离心管的放置方向，保持沉淀方向一致或作好标记。以利于用移液管移吸上清，不会搅动沉淀。另外，抽吸剩下少量（约 50 ml）溶液可再离心一次，之后全部吸出上清。

2、用 ml 70%酒精加入微量离心管中（洗涤DNA ），在3000 rpm 转速下离心5 min。先用移液器从沉淀小球对面移去大部分酒精，抽吸剩下少量（约50 ml）溶液再置于3000 rpm 转速下离心5 min。然后移出酒精，在通风处或超净工作台送风条件下风干，但不宜过干，过干很很难溶解。

3、用20 µl TE缓冲液（pH 8）溶解DNA ，置于冰上，每0 min 弹击微量离心管，以促进DNA 溶解。之于置于4℃条件下过夜。ELISA试剂盒

4、第三天可将DNA 取出，在60℃条件下预热一小时，每0 min 弹击微量离心管，以促进DNA 溶解。之后在%的琼脂糖胶上鉴定。