（）待测样品孔中每孔加入待测样品00μl，每种样品设3个平行孔；设两个阴性对照孔，每孔加未处理组的细胞裂解液00μl；另设一个空白对照孔，加入纯细胞裂解液00μl。　（2）酶标板置4℃，包被过夜。

　　（3）洗板：吸干孔内反应液，用洗涤液过洗一遍（将洗涤液注满板孔后，即甩去），之后将洗涤液注满板孔，浸泡-2分钟，间歇摇动。甩去孔内液体后在吸水纸上拍干。重复洗涤3-4次。

　　（4）阴性对照孔每孔加入PBS 50μl，样品孔及空白孔每孔加入:500稀释的兔抗人AIF抗体工作液50μl。

　　（5）酶标板置37℃培养箱的湿盒内，孵育60min。

　　（6）洗板，同（4）。

　　（7）每孔加:5000稀释的HRP-标记的山羊抗兔抗体工作液 00μl。

　　（8）酶标板置37℃培养箱的湿盒内，孵育60min。

　　（9）洗板，同（4）。

　　（0）每孔加TMB显色液 00μl，轻轻混匀0s，置37℃暗处反应5-20min。

　　（）每孔加00μl 2mol/L H2SO4终止反应。

　　（2）分别测450nm 吸光值W和630nm吸光值W2，zui终测得的OD值为两者之差（W-W2），以减少由容器上的划痕或指印等造成的光干扰。

　　（3）数据处理：在得出标本（S）和阴性对照（N）的 OD值后，计算S/N值。S/N≥2.为阳性判定标准。

　　注：所用溶液配方

　　（） PBS：称取0.2g KH2P04, 2.9g Na2HP04?2H20、8.0g NaCl, 0.2g KCl，加双蒸水至000ml。

　　（2）包被缓冲液：称取.59g Na2CO3, 2.938 NaHCO3，加双蒸水至 000m。

　　（3）洗涤液（PBST）：含0.05% Tween-20的PBS。

　　（4）稀释液：含0.%牛血清白蛋白（BSA）的PBS，主要用以稀释抗体、标准品、样品。

　　（5）TMB显色液：称取.84g Na2HP04.2H20, 0.5 g柠檬酸，加双蒸水至O0ml，配成柠檬酸-磷酸缓冲溶液。用0.5 ml 柠檬酸-磷酸缓冲溶液溶解锭TMB，再加入35μl 3% H2O2

　　（6）细胞裂解液：% TritonX-00，37mmol/L NaCl，20mmol/L Tris-HCl，2mmol/L EDTA，mmol/L PMSF，pH 7.4。（其中PMSF溶于异丙醇中，配成O mmo/L，-20℃ 贮存备用。