游离氨基酸的氨基可与水合茚三酮反应,产生蓝紫色化合物,其颜色的深浅与游离氨基酸的含量成正比。
分光光度计;电子天平;容量瓶25ml或50ml 3个;漏斗(直径6厘米)3个、滤纸适量;20ml刻度试管 7支;移液管0.5ml 3支、5ml 支;试管架;玻棒;吸耳球;剪刀;移液管架;橡皮筋、塑料薄膜(封试管口);吸水纸;擦镜纸适量;电炉;水浴锅(含铁丝筐)。
.3%茚三酮试剂 称3g茚三酮用95%乙醇溶解定容到00ml容量瓶里,贮于棕色瓶中。此试剂应放在冷凉处,不宜久放,使用期约0天。
2.氰酸盐缓冲液(按以下方法配制):
()NaCN贮备液0.0mol/L(490mg/L)。
(2)醋酸缓冲液:称360g醋酸钠(含三分子结晶水)溶于约300ml无氨蒸馏水中,加66.67ml冰醋酸再用无氨蒸馏水稀释至L。
取溶液()20ml,用溶液(2)定容到L。
3.标准氨基酸 称取在80℃下烘干的3.mg(或α-8.9mg)溶于0%的异丙醇中,并在00ml容量瓶中用0%异丙醇稀释至刻度,混匀,即为mmol/L的标准氨基酸贮备液,置冰箱中保存。为了制备工作液,可取贮备液与等量无氨蒸馏水混合,此液浓度为0.5mmol/L,即ml含氨基酸0.5μmol,或氨基氮7μg。
4.95%乙醇;5.异丙醇(分析纯)。
.标准曲线的制作 取20ml刻度试管8支,按下表5-加入各试剂。加完试剂后混匀,在00℃水浴中加热2min(加热时封口),取出在冷水中迅速冷却,立即于每管中加入5ml 95%乙醇,塞好塞子,猛摇试管,使加热时形成的红色产物被空气中的氧所氧化而褪色,此时溶液呈蓝紫色。于570nm波长下测其光密度(以空白管为参比),以氨基酸浓度为横坐标,光密度为纵坐标,绘制标准曲线,求出直线方程。
2.样品提取 选取有代表性的植物叶片(或其它组织),洗净擦干,剪碎混匀,迅速称取0.0~0.20g(视氨基酸含量多少而定),共称3份,分别加入20ml刻度试管中,再加蒸馏水0ml盖塞(或系上塑料薄膜),置沸水浴中20min以提取游离氨基酸,到时取出在自来水中冷却,把上清液滤入25ml容量瓶中,之后再往试管中加5ml蒸馏水,置沸水浴上再加热0min,过滤并反复冲洗残渣,zui后定容至刻度,摇匀。
3.样品测定 另取4支洁净干燥的试管,其中3支分别加入0.5ml提取液,另一支加0.5ml蒸馏水,然后在上述4支试管中分别加入NaCN缓冲液、水合茚三酮各0.5ml,加完试剂后盖塞,置沸水浴上加热2min,冷却后,再分别加5ml 95%乙醇,摇匀,以空白作参比,在波长570nm下测其光密度。