在一步法PⅢNP Elisa试剂盒测定中，当标本中受检抗原的含量很高时，过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合，而不再形成"夹心复合物"。类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象，ELISA试剂盒此时反应后显色的吸光值(位于抗原过剩带上)与标准曲线(位于抗体过剩带上)某一抗原浓度的吸光值相同，如按常法测读，所得结果将低于实际的含量，这种现象被称为钩状效应(hook effect)，因为标准曲线到达高峰后呈钩状弯落。钩状效应严重时，反应甚至可不显色而出现假阴性结果。因此在使用一步法试剂测定标本中含量可异常增高的物质(例如血清中HBsAg、AFP和尿液hCG等)时，应注意可测范围的zui高值。用高亲和力的单克隆抗体制备此类试剂可削弱钩状效应。
    其原理为利用酶标记的抗抗体(抗抗体)以检测与固相抗原结合的受检抗体，故称为间接法。PⅢNP Elisa试剂盒操作步骤如下：
)将特异性抗原与固相载体联结，形成固相抗原。洗涤除去未结合的抗原及杂质。
2)加稀释的受检血清，保温反应。血清中的特异抗体与固相抗原结合，形成固相抗原抗 体复合物。经洗涤后，固相载体上只留下特异性抗体，血清中的其他成份在洗涤过程中被洗去。
3)加酶标抗抗体。可用酶标抗人Ig以检测总抗体，ELISA试剂盒但一般多用酶标抗人IgG检测IgG抗 体。固相免疫复合物中的抗体与酶标抗体抗体结合，从而间接地标记上酶。洗涤后，固相载体上的酶量与标本中受检抗体的量正相关。
4)加底物显色
    本法主要用于对病原体抗体的检测而进行传染病的诊断。ELISA试剂盒间接法的优点是只要变换包被抗原就可利用同一酶标抗抗体建立检测相应抗体的方法。
    间接法成功的关键在于抗原的纯度。虽然有时用粗提抗原包被也能取得实际有效的结果，但应尽可能予以纯化，以提高试验的特异性。特别应注意除去能与一般健康人血清发生反应的杂质，例如以E.Coli为工程酶的重组抗原，如其中含有E.Coli成份，ELISA试剂盒很可能与受过E.Coli感染者血甭中的抗E.Coli抗体发生反应。抗原中也不能含有与酶标抗人Ig反应的物质，例如来自人血浆或人体组织的抗原，如不将其中的Ig去除，PⅢNP Elisa试剂盒试验中也发生假阳性反应。另外如抗原中含有无关蛋白，也会因竟争吸附而影响包被效果。