Fura-2，五铵盐mg说明书

注意事项：
Fura-2，五铵盐mg说明书● 溶液PE *次使用前请按瓶上标签加入4 倍体积的无水乙醇，即5 ml 溶液PE 中加入60 ml 无水乙醇，20 ml 溶液PE 中加入80 ml 无水乙醇，使用后立即盖紧盖子。
● 本产品对电泳使用的Agarose 种类没有严格限制，可以使用普通Agarose 。为了保证回收DNA 的质量和DNA 回收效率，希望使用高纯度的Agarose ，但没有必要一定要使用低熔点的Agarose 等。
● 电泳时请使用新鲜配制的TAE 电泳缓冲液，以免影响电泳及回收效果。
● 请适当延长电泳时间，在条带分离清晰后进行切胶回收，以免回收到多余杂带。
● 为提高DNA 回收收率，切胶时应尽量除去多余的胶块。
● 本试剂盒纯化柱的DNA 吸附能力强。但如果DNA 浓度小，或DNA 初始量少，回收率将会偏低。
● 溶液Eluent（0 mM Tris-HCl, pH 8.5）中不含EDTA，其收集的DNA 片段可直接用于各种酶促反应等，不会影响后续试验。
● 为了保证回收效率，请不要使用未调整pH 值的超纯水洗脱目的片段。

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● 请严格按照操作步骤操作。

问：常用的DNA 浓度及纯度检测方法有哪些？
Fura-2，五铵盐mg说明书答：回收得到的DNA 片段可用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测浓度与纯度。琼脂糖凝胶电泳通过对比定量的Marker 来定量浓度；紫外分光检测OD260/280 比值，OD260/280 比值在.7-.9 之间说明所得  DNA  纯度较好，如果洗脱时不使用溶液Eluent而使用去离子水，比值会偏低，因为pH 值和离子存在会影响光吸收值，但不表示纯度低。

问：长片段回收时应注意哪些问题？
答：Fura-2，五铵盐mg说明书当DNA 片段长度较长（5   kb 以上）时，回收效率会有所下降，这是DNA 切胶回收时的常见现象。此时建议按以下方法解决问题：
    适当增加待回收DNA 样品的点样量；
    2 由于长片段DNA 不易从树脂上洗脱下来，建议洗脱两次，可以提高洗脱效率；
    3 减少操作过程中对长片段DNA 的物理损伤，如混合振荡操作不要过于剧烈，切胶时不要将DNA 长时间暴露在紫外等下。

操作步骤：
  Fura-2，五铵盐mg说明书切取含有目的DNA 片段的琼脂糖凝胶条带。
   ● 尽量切除不含有目的DNA 部分的凝胶，减少凝胶体积，提高DNA 回收率。
   ● 切胶时，请使用长波长UV  （360 nm ）光盒。且不要将DNA 长时间暴露在紫外灯下，以防DNA 损伤。
2  称取凝胶的重量近似地确定其体积。
   ● 凝胶重量的称量方法：取.5 ml 离心管电子天平称初质量，切胶装在离心管后称终质量，两者差即为胶的质量。不同离心管的重量可能有差异，因此，每个离心管的重量需单独称量。
3  按照每00 mg 琼脂糖凝胶对应00 µl 溶液BD 的比例，向离心管中加入溶液BD。
4  50 ℃水浴7-0min，直至凝胶*溶化。期间需要振荡混合3 次。
   ● 琼脂糖必须*融化，以免堵塞柱子，严重影响DNA 段的回收效率。
   ● 如果总体积大于500 µl，可适当增加溶胶时间。
   ● 若此时溶液变红，可加0 µl 3M NaAC  （pH 5.2）。
5  将步骤4 所获溶液置于DNA 纯化柱中，静置2min 。
   ● 胶块*溶解后将胶溶液温度降至室温再上柱，因为纯化柱在较高温度时结合DNA  的能力较弱。
6  2,000 rpm 离心min。若溶液量大于DNA 纯化柱的容积，可分两次离心，弃滤液。
   ● 此时DNA 被吸附于DNA 纯化柱中的硅胶膜上。
7  加入500 µl 溶液BD。2,000 rpm,  离心min，弃滤液
8  加入500 µl 溶液PE。2,000 rpm,  离心min，弃滤液。
   ● 溶液PE 初次使用前用无水乙醇按: 4 稀释，即含80% 乙醇。
   ● 此步骤的作用是将硅胶膜上吸附的蛋白、盐等杂质洗脱，以获得高质量DNA 段。
9  加入500 µl 溶液PE。2,000 rpm,  离心min，弃滤液。
0 2,000 rpm 离心  3min ，以*去除纯化柱中的液体。
   ● 此步骤的作用是去除残留乙醇，避免残留乙醇影响后续酶促反应。同时也利于DNA 段的充分溶解。
  将离心柱置于新的.5 ml 离心管中。向纯化柱的处，悬空滴加30-00 µl 溶液Eluent  （60℃预热），静置2min 。2,000 rpm  离心min，管底即为目的DNA 段。贮存于-20℃。
   ● 溶液Eluent 可用无菌双蒸水代替，但其pH 需为8.0-8.5，加入体积视DNA 目的段的多少、用户对目的浓度要求而定。
   ● 对溶液Eluent 60℃预热，会提高提取DNA 目的段的产量。

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